Cyclin D1启动子在养精胶囊促进小鼠精原干细胞增殖中的作用^※

Cyclin D1启动子在养精胶囊促进小鼠精原干细胞增殖中的作用 ※ first-author corresp 金保方，男，医学博士，主任医师，副教授，博士研究生导师。主要从事男科疾病的中西医结合临床研究。E-mail：hexiking@126.com 金保方，男，医学博士，主任医师，副教授，博士研究生导师。主要从事男科疾病的中西医结合临床研究。E-mail：hexiking@126.com hexiking@126.com 东南大学附属中大医院中西医结合男科（江苏 南京 210009） 东南大学附属中大医院中西医结合男科（江苏 南京 210009） 蒋艺芬 目的 2 研究养精胶囊促进小鼠精原干细胞（SSCs）增殖的分子机制。 方法 2 将不同浓度的养精胶囊提取物加入SSCs中培养48 h，CCK-8检测细胞的增殖活性，流式细胞仪检测细胞周期，荧光素酶报告基因检测Cyclin D1启动子的活性，qRT-PCR以及免疫荧光检测Cyclin D1的表达。之后进行阻断实验，在加入养精胶囊前预先加入siRNA-Cyclin D1，同样的方法检测细胞的增殖活性、细胞周期、Cyclin D1启动子的活性以及Cyclin D1的表达情况。 结果 2 低、中、高浓度的养精胶囊可以促进SSCs的增殖，提高S期细胞的比例，增强Cyclin D1启动子的活性，促进Cyclin D1的表达。阻断Cyclin D1后，SSCs的增殖活性降低，S期细胞比例减少，Cyclin D1启动子的活性降低，Cyclin D1的表达减少。 结论 2 养精胶囊通过增强Cyclin D1启动子的活性提高Cyclin D1的转录和翻译水平，进而促进SSCs增殖。 养精胶囊 精原干细胞 细胞周期蛋白D1 细胞增殖 精原干细胞（spermatogonia stem cells，SSCs）是精子发生的物质基础，它的增殖和分化涉及多条通路、多个基因的精密调控 [ 1 1 ] 。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）由位于人染色体11q13的CCND 1基因编码，是调控SSCs的重要蛋白，它能够参与细胞周期的精确调控，维持SSCs自身数目的相对恒定，为精子发生提供源源不断的原料 [ 2 2 ] 。Cyclin D1作为细胞周期的启动因子，作用于G1期，促进G1/S期的过渡，提高S期细胞的比例，进而促进SSCs的增殖 [ 3 3 ] 。许多生长因子如胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可以作用于SSCs表面相应受体，将信号传递到细胞内，进而上调细胞核内Cyclin D1的表达，促进SSCs的增殖 [ 4 4 ] 。 养精胶囊（Yangjiing Capsule，YC）是笔者团队在临床上常用的男科方剂，用于治疗由少弱精症导致的男性不育，疗效确切。前期研究发现，养精胶囊作用于小鼠SSCs 48 h后，细胞周期中S期细胞比例明显增加，说明养精胶囊能够促进小鼠SSCs由G1期向S期的过渡，进而促进细胞增殖 [ 5 5 ] 。鉴于Cyclin D1在SSCs增殖中的重要作用，笔者猜测养精胶囊可能通过Cyclin D1发挥作用。因此，本研究的目的是研究养精胶囊是否通过Cyclin D1促进SSCs的增殖。 1 材料和方法 1 1.1　细胞分离及培养 2 取4~6 d雄性BALB/c小鼠的睾丸，运用改良的两步消化法+差速贴壁分选获得高度纯化的SSCs，种植到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，每2 d更换培养液1次。具体步骤见参考文献 [ 6 6 ] 。 1.2　主要试剂与药品 2 CCK-8试剂盒、细胞周期试剂盒、免疫荧光检测相关试剂（碧云天，中国）；细胞总RNA提取试剂（Trizol法）、反转录试剂盒、定量PCR检测试剂盒（诺唯赞，中国）；重组小鼠GDNF（Pepro Tech，美国）；兔抗鼠Cyclin D1抗体（ab16663，Abcam，美国）；山羊抗兔二抗（ab150077，Abcam，美国）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（promega，美国）；养精胶囊由中国人民解放军东部战区总医院制剂科生产提供[院临（2004）第01002号]。养精胶囊水提物提取方法见参考文献 [ 7 7 ] 。 1.3　细胞增殖检测 2 在96孔板中以4×10 3 /孔的密度接种细胞悬液，放在培养箱中预培养24 h，将其随机标记为空白对照组(Control Group)、养精胶囊低剂量组（YC extract 0.01 mg/mL Group）、养精胶囊中剂量组（YC extract 0.1 mg/mL Group）、养精胶囊高剂量组（YC extract 1 mg/mL Group）、阳性对照组(GDNF Group)。空白对照组未作处理，养精胶囊低、中、高剂量组分别加入0.01、0.1、1 mg/mL的养精胶囊，阳性对照组加入20 ng/mL的GDNF。48 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，然后将培养板置于培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。细胞增殖率=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。至少进行三次独立重复实验。 1.4　细胞周期检测 2 按“1.3”进行分组并加入相应的药物，之后将细胞在冰浴预冷的70%乙醇中重悬，4 ℃固定过夜。1000 g左右离心3 min沉淀细胞，之后加入冰浴预冷的PBS重悬细胞，每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色复合液，37 ℃避光温浴30 min。然后使用FACScan流式细胞仪对样本进行分析，采用ModFit LT 3.0软件评价G0/G1期、S期、G2/M期细胞百分比。至少进行三次独立重复实验。 1.5　荧光素酶报告基因实验 2 在24孔板中以5×10 4 /孔的密度接种细胞悬液，细胞培养过夜后，转染体系：每个转染3个孔，每孔加入1 μL Lipo 3000+1 μg pRL-TK质粒+1 μg pGL3-Cyclin D1 promoter-luci质粒（或者pGL3空载质粒）。对其进行分组，阴性对照组(YC extract+pGL3-ctrl Group)为转染pGL3空载质粒24 h后再加入1 mg/mL养精胶囊，养精胶囊组（YC extract+pGL3-Cyclin D1 Group）和阳性对照组(GDNF+pGL3-Cyclin D1 Group)分别为转染pGL3-Cyclin D1 promoter-luci质粒24 h后再加入1 mg/mL的养精胶囊和20 ng/mL的GDNF，轻轻混匀，放入培养箱中培养。48 h后，用PBS轻轻洗2遍，每个孔中加入100 μL细胞裂解液，放在冰上裂解5 min，将裂解的细胞分别转移至EP管中，12000 rpm离心2 min，分别取40 μL上清转移至96孔板中，将LARII、stop & glo试剂配制好，和96孔板一起放入GloMax 96微孔板发光检测仪中，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。pGL3-Cyclin D1 promoter-luci质粒委托上海捷瑞生物设计并合成。至少进行三次独立重复实验。 1.6　实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）实验 2 将接种了细胞悬液的孔板随机分为空白对照组(Control Group)、养精胶囊组（YC extract Group）、阳性对照组(GDNF Group)。空白对照组未作处理，养精胶囊组加入1 mg/mL的养精胶囊，阳性对照组加入20 ng/mL的GDNF，作用48 h之后将细胞用Trizol试剂提取总RNA，之后用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模版进行扩增，所用引物由上海捷瑞生物设计并合成。PCR扩增引物序列如下：Cyclin D1上游引物为5’-GATGAAGGAGACCATTCCCTTG-3’，下游引物为5’-TCACCAGAAGCAGTTCCATTT-3’；GAPDH上游引物为5’-GGGTGTGAACCACGAGAAATA-3’，下游引物为5’-GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3’。 加样体系按照定量PCR检测试剂盒说明进行操作，反应采用标准的两步法：95 ℃、1 min，1个循环；95 ℃、 15 s，60 ℃、1 min，40个循环，采用溶解曲线判断扩增产物是否单一，采用2 —△△Ct 法计算表达量的相对比值。至少进行三次独立重复实验。 1.7　细胞免疫荧光（immunofluorescence，IF）实验 2 将2 cm×2 cm载玻片灭菌后置于6孔板中，细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，接种于6孔板中，培养24 h，按“1.6”对其进行分组，在37 ℃、5% CO 2 培养箱中培养48 h后，加入4%多聚甲醛固定10～15 min，加入0.2% Trinton X-100透化15 min，每张玻片加入羊血清150 μL，封闭30 min后，加入兔抗鼠Cyclin D1抗体（1：200），4 ℃过夜，加入山羊抗兔二抗（1：1000），37 ℃孵育1 h，加入1 μg/mL DAPI染色15 min，PBS冲洗后，甘油封片，于荧光显微镜下观察并照相。至少进行三次独立重复实验。 1.8　细胞阻断实验 2 委托上海捷瑞生物针对Cyclin D1基因设计干扰RNA（siRNA）序列，同时设计一条阴性对照（siRNA-NC）序列，通过BLAST验证该序列对于其他基因无干扰效果。siRNA-Cyclin D1引物序列为CAGGATGATGAAGTGAACACACTCA；siRNA-NC引物序列为GTACCAACAAGACAGTGCTAGTAGA。 转染siRNA-Cyclin D1之前先将SSCs以1×10 5 /孔接种至六孔板中，待细胞长至60%密度时采用Lipo 3000将siRNA-Cyclin D1/siRNA-NC转染进细胞，37 ℃孵育24 h后加入1 mg/mL的养精胶囊提取液，根据所转染的基因序列相应地分为养精胶囊+siRNA-Cyclin D1组（YC extract+siRNA-Cyclin D1 Group）与养精胶囊+siRNA-NC组（YC extract+siRNA-NC Group），继续培养48 h进行后续检测。至少进行三次独立重复实验。 1.9　数据统计方法 2 所有数据都采用SPSS 20.0统计软件分析。各组计量资料采用均数±标准差( <math id="M1"><mover><mrow><mi>x</mi></mrow><mo>¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=17338835&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=17338832&type= 7.28133297 3.21733332 )表示。符合正态分布的两组定量数据的比较，采用 two-tailed Student’s t-test 分析；非正态分布的两组定量数据的比较，采用 Mann-Whitney U 检验。 P < 0.05认为差异具有统计学意义。 2 结果 1 2.1　养精胶囊对SSCs增殖活性、细胞周期的影响 2 图1 图1 A表明，在SSCs培养液中分别加入0.01、0.1、1 mg/mL浓度的养精胶囊48 h后，与空白对照组相比，细胞的增殖活性分别提高了19.8%、68.4%、78.0%，有统计学差异（ P < 0.05， P < 0.01），表明低、中、高剂量的养精胶囊均能促进SSCs的增殖；阳性对照组与空白对照组相比，细胞的增殖活性提高了118.0%，有统计学差异（ P < 0.01）。 图1 图1 B表明，0.1、1 mg/mL浓度的养精胶囊作用48 h后，S期细胞的比例比空白对照组分别提高了8.2%、26.4%，有统计学差异（ P < 0.05， P < 0.01），表明中、高剂量的养精胶囊均能提高S期细胞的比例；阳性对照组与空白对照组相比，S期细胞的比例提高了36.7%，有统计学差异（ P < 0.01）。 注： 图A为CCK-8实验检测养精胶囊对SSCs增殖活性的影响；图B为流式细胞仪检测养精胶囊对SSCs细胞周期的影响；与空白对照组比较， * P < 0.05， ** P < 0.01 2.2　养精胶囊对Cyclin D1 启动子、mRNA和蛋白水平的影响 2 图2 图2 A表明，高剂量（1 mg/mL）的养精胶囊和GDNF作用48 h后，Cyclin D1启动子的活性比阴性对照组分别增强103.7%、121.3%，有统计学差异（ P < 0.01），说明高剂量的养精胶囊和GDNF均能增强Cyclin D1启动子的活性。 图2 图2 B表明，高剂量的养精胶囊和GDNF作用48 h后，Cyclin D1 mRNA的表达比空白对照组分别提高85.5%、106.4%，有统计学差异（ P < 0.01），说明高剂量的养精胶囊和GDNF均能提高Cyclin D1 mRNA的表达。 图2 图2 C表明，高剂量的养精胶囊和GDNF作用48 h后，Cyclin D1的蛋白表达提高，并且主要集中在细胞核内。 注： 图A为荧光素酶报告基因实验检测精胶囊对Cyclin D1启动子的影响；图B为qRT-PCR检测养精胶囊对Cyclin D1 mRNA水平的影响；图C为免疫荧光检测养精胶囊对Cyclin D1蛋白水平的影响；与空白对照组比较， ** P < 0.01 2.3　阻断Cyclin D1后养精胶囊对SSCs的影响 2 图3 图3 A表明，加入siRNA-Cyclin D1预处理后再加入高剂量的养精胶囊培养48 h，细胞的增殖活性比养精胶囊+siRNA-NC组降低23.9%，有统计学差异（ P < 0.01），表明阻断Cyclin D1能够抑制SSCs的增殖。 图3 图3 B表明，养精胶囊+siRNA-Cyclin D1组与养精胶囊+siRNA-NC组相比，S期细胞比例减少12.9%，有统计学差异（ P < 0.01），表明阻断Cyclin D1能够降低S期细胞比例。 注： 图A为CCK-8实验检测阻断后养精胶囊对SSCs增殖活性的影响；图B为流式细胞仪检测阻断后养精胶囊对SSCs细胞周期的影响；与空白对照组比较， ** P < 0.01；与养精胶囊+siRNA-NC组比较， ## P < 0.01 2.4　阻断Cyclin D1后养精胶囊对Cyclin D1的影响 2 图4 图4 A表明，加入siRNA-Cyclin D1预处理后再加高剂量的养精胶囊培养48 h，Cyclin D1启动子的活性与养精胶囊+siRNA-NC组相比降低18.6%，有统计学差异（ P < 0.01）。 图4 图4 B表明，养精胶囊+siRNA-Cyclin D1组与养精胶囊+siRNA-NC组相比，Cyclin D1 mRNA的表达降低15.6%，有统计学差异（ P < 0.05）。 图4 图4 C表明，养精胶囊+siRNA-Cyclin D1组与养精胶囊+siRNA-NC组相比，Cyclin D1的蛋白表达降低。 注： 图A为荧光素酶报告基因实验检测阻断后养精胶囊对Cyclin D1启动子的影响；图B为qRT-PCR检测阻断后养精胶囊对Cyclin D1 mRNA水平的影响；图C为免疫荧光检测阻断后养精胶囊对Cyclin D1蛋白水平的影响；与空白对照组比较， ** P < 0.01；与养精胶囊+siRNA-NC组比较， # P < 0.05， ## P < 0.01 3 讨论 1 养精胶囊是东南大学附属中大医院金保方教授运用中医学“肾藏精”的理论，以补肾填精、益气活血为法创立的经验方，由淫羊藿、熟地、黄精、紫河车、沙苑子、煅牡蛎、黄芪、当归、荔枝核、王不留行、炙水蛭共11味中药组成。方中淫羊藿味辛、甘，性温，走肝肾二经，为补命门、益精气之要药；熟地味甘，性微温，亦归肝肾二经，有补血养阴、填精益髓之功，九蒸九晒熟地为补血之首剂，与淫羊藿相伍，阴阳互根互用，增强疗效；紫河车乃血肉有情之品，扶正固本，养血益精；黄芪-黄精为补气养阴固精的常用药对，气阴双补，使得阳有所依；沙苑子、煅牡蛎其性下行，补肾固精，煅牡蛎还含有精子生长所必须的锌、硒等微量元素；荔枝核、当归、炙水蛭、王不留行共奏行气活血之功，使得药物补而不滞，滋而不腻。方中除了传统补肾填精之药，还添加了行气活血之药，既能补肾入精室，又能行气活血以养精生精。这种补肾填精与行气活血药物的配合，可改善睾丸和附属性腺的内环境，促进精子发生，提高临床疗效 [ 8 8 - 11 11 8-11 ] 。 Cyclin D是1991年由Motokura等 [ 12 12 ] 在研究甲状旁腺癌时首先分离，主要包括Cyclin D1、D2、D3三个亚型，三者在氨基酸序列上有高度同源性。Ciraolo等 [ 4 4 ] 研究发现，GDNF通过激活PI3K中的p110α亚基引起下游Akt的磷酸化，进而上调Cyclin D1的表达，促进SSCs的自我更新与增殖。本研究发现养精胶囊可以促进SSCs的增殖、提高S期细胞的比例（ 图1 图1 ），并且增强Cyclin D1启动子的活性，促进Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达（ 图2 图2 ）。为了研究养精胶囊是否通过Cyclin D1产生作用，本研究运用siRNA-Cyclin D1阻断Cyclin D1的表达，发现阻断Cyclin D1之后，SSCs的增殖活性降低、S期细胞比例减少（ 图3 图3 ），同时伴随着Cyclin D1启动子的活性降低，mRNA和蛋白的表达减少（ 图4 图4 ）。 综上，养精胶囊可以通过增强Cyclin D1启动子的活性提高Cyclin D1的转录和翻译水平，进而促进SSCs增殖。这对于阐明补肾填精法改善男性生殖功能的作用靶点，揭示“肾藏精”的科学内涵，进而指导临床运用中药治疗少弱精症，具有重要的理论意义和临床价值。当然，基因的转录涉及启动子、转录因子、RNA聚合酶等的协同作用，养精胶囊如何增强Cyclin D1启动子的活性的分子机制有待进一步探索。 参考文献 Kanatsu-Shinohara M , Shinohara T . 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