基于网络药理学技术解析海马“壮阳、益精”功效的物质基础、潜在靶点与分子机制^※

基于网络药理学技术解析海马“壮阳、益精”功效的物质基础、潜在靶点与分子机制 ※ 1 first-author 2 1 2 corresp 许光辉，男，副研究员，医学博士，硕士研究生导师。主要从事中药、天然药物生物活性与作用机制研究。E-mail：xghcxm@163.com 许光辉，男，副研究员，医学博士，硕士研究生导师。主要从事中药、天然药物生物活性与作用机制研究。E-mail：xghcxm@163.com xghcxm@163.com 3 4 福建中医药大学药学院（福建 福州 350122） 福建中医药大学药学院（福建 福州 350122） 厦门市医药研究所 厦门市天然药物研究与开发重点实验室（福建 厦门 361008） 厦门市医药研究所 厦门市天然药物研究与开发重点实验室（福建 厦门 361008） 福建省水产研究所（福建 厦门 361012） 福建省水产研究所（福建 厦门 361012） 厦门小嶝水产科技有限公司（福建 厦门 361100） 厦门小嶝水产科技有限公司（福建 厦门 361100） 金冠羽 目的 2 运用网络药理研究技术探讨中药海马“壮阳、益精”功效的物质基础、潜在靶点和分子机制。 方法 2 通过检索中国知网（CNKI）和国际性综合生物医学信息书目数据库（Medline）构建中药海马的功效成分数据库，运用网络药理学技术对药物成分靶点、疾病靶点、疾病-成分核心靶点 KEGG 通路、基因本体（GO）等进行关联算法分析。 结果 2 筛选得到海马壮阳功效成分核心靶点 133 个，涉及 39 条相关信号通路；益精功效成分核心靶点 7 个，涉及 2 条信号通路；海马“壮阳、益精”功效的重要靶点显著富集在癌症发生、糖尿病、免疫、炎症相关的 7 条信号通路。 结论 2 本研究从网络药理学角度初步阐释了氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等成分均为中药海马“壮阳、益精”的功效物质，其作用机制可能与癌症发生、炎症、免疫与糖尿病等相关信号通路的调节有关。 海马 网络药理学 阳痿 弱精症 物质基础 分子机制 海马（Haima，拉丁学名：hippocampus）为脊索动物门硬骨鱼纲海龙科海马属动物，是我国传统的名贵中药材，素有“南方人参”的美誉 [ 1 1 ] ；味甘、咸，性温，归肝、肾经，具有温肾壮阳、益精种子、止咳平喘、活血通脉、散结消肿之效，主治肾阳不足所致诸证 [ 2 2 ] 。药理研究证实，海马具有性激素样作用、抗疲劳、抗氧化、提高机体免疫力、抗肿瘤、镇静安神等药理活性 [ 3 3 ] 。 近年来，随着我国海马养殖技术的日渐成熟，我国福建、广东等沿海部分地区已实现了海马的规模化养殖 [ 4 4 ] 。海马的工厂化养殖，解决了长期以来药用海马基原不清、质量难控等难点，推动了海马的进一步开发利用。本研究针对目前海马“壮阳、益精”功效的药物应用热点 [ 5 5 ] ，采用网络药理研究方法，筛选海马的物质基础及作用靶点，明确海马发挥壮阳、益精功效的分子机制，为海马的深度开发提供实验依据。 1 材料与方法 1 1.1　相关数据库与软件 2 中国知网（ https://www.cnki.net/ https://www.cnki.net/ ）；Medline数据库（ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ ）；Pubchem数据库（ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）；GeneCards数据库（ https://www.genecards.org/ https://www.genecards.org/ ）；STRING数据库（ https://string-db.org/ https://string-db.org/ ）；DAVID 6.8数据库（ http://david.abcc.ncifcrf.gov/ http://david.abcc.ncifcrf.gov/ ）；RCSB PDB数据库（ https://www.rcsb.org/ https://www.rcsb.org/ ）；Cytoscape v3.8.0 分析软件（ https://cytoscape.org/ https://cytoscape.org/ ）。 1.2　海马主要化学成分与“壮阳、益精”功效相关疾病靶点数据集构建 2 以CNKI、Medline等数据库及相关学术资料为主要数据来源 [ 6 6 - 9 9 6-9 ] ，对《中华人民共和国药典》 [ 10 10 ] 所收录的5种海马的主要化学成分及其含量进行收集、归类，取化学成分合集建立海马化学总成分集；根据化合物的含量、口服吸收利用度和靶点数目等指标，组成本研究所需的海马主要功效成分集。 现代药理研究表明，海马补肾壮阳功效主要体现在改善勃起功能障碍（ED）和弱精症（AS）两个方面 [ 11 11 - 12 12 11-12 ] 。本研究通过Gene card数据库获取ED和AS对应靶标，构建中药海马“壮阳、益精”功效相关的疾病靶点数据集。 1.3　海马“壮阳、益精”功效潜在靶点筛选 2 利用在线软件Venny2.1.0 ( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html )获取海马主要功效成分集与ED、AS疾病靶点数据集的交集数据，并绘制相应的韦恩图。 1.4　“药物-疾病共有靶点”相互作用分析 2 应用在线STRING平台（ https://string-db.org/ https://string-db.org/ ），分别对海马“壮阳、益精”功效潜在靶点进行相互作用关系分析。应用Cytoscape 3.8.0软件构建靶点蛋白交互网络图（PPI），计算相应的网络拓扑参数，以度值大于中数的节点为核心节点。 1.5　核心靶点的基因本体（GO）与信号通路(KEGG)富集分析 2 将筛选的核心靶点上传至DAVID 6.8在线数据分析平台（ https://david.ncifcrf.gov/ https://david.ncifcrf.gov/ ）进行GO和KEEG富集分析，以 P < 0.01为显著差异筛选海马“壮阳、益精”功效潜在靶点涉及的生物过程和信号通路，分析其分子机制。 2 结果 1 2.1　海马“壮阳、益精”功效成分筛选 2 现有文献检索结果表明，5种海马共有的化学成分以氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等化合物为主，其中水解氨基酸平均含量高达海马干重的64.2% [ 13 13 ] ，其次是脂肪酸，约占海马干重的2.9%~4.8%，甾体类约占海马干重的0.33%~0.78% [ 14 14 ] 。根据成分含量、口服生物利用度（OB）、类药性（DL）及参与调节相关基因的数目（Number of related genes）等指标综合筛选，纳入氨基酸21种、脂肪酸14种、甾体类7种和磷脂5种等4大类化合物进行网络药理分析。见 表1 表1 。 序号 名称 口服生物利用度 类药性 靶基因数目 序号 名称 口服生物利用度 类药性 靶基因数目 1 色氨酸 75.93 0.08 30 25 二十烷酸 16.66 0.19 159 2 苏氨酸 73.52 0.01 802 26 二十二烷酸 15.69 0.26 134 3 亮氨酸 72.92 0.01 489 27 二十二碳六烯酸 65.67 0.04 653 4 甲硫氨酸 70.87 0.01 288 28 二十碳四烯酸 45.57 0.2 390 5 异亮氨酸 59.05 0.02 66 29 二十碳五烯酸 45.16 0.21 526 6 缬氨酸 53.33 0.01 194 30 十八碳三烯酸 45.01 0.15 108 7 苯丙氨酸 41.62 0.04 231 31 十八碳二烯酸 41.9 0.14 110 8 赖氨酸 29.33 0.02 16 32 十六碳烯酸 35.78 0.1 3 9 丝氨酸 83.59 0.01 1646 33 十八碳烯酸 33.13 0.14 118 10 酪氨酸 57.55 0.05 1788 34 二十碳烯酸 30.7 0.2 18 11 组氨酸 53.18 0.03 278 35 十六碳二烯酸 ­ ­ 83 12 甘氨酸 48.74 0 44 36 胆固醇 37.87 0.68 640 13 精氨酸 47.64 0.03 777 37 胆甾-4-烯-3-酮 37.18 0.68 51 14 鸟氨酸 47.64 0.03 113 38 谷甾-5,22-二烯-3-醇 36.91 0.75 100 15 胱氨酸 39.58 0.05 39 39 3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮 ­ ­ 117 16 牛磺酸 24.37 0.01 62 40 雄甾-4-烯--3,17-二酮 ­ ­ 91 17 丙氨酸 85.17 0.01 846 41 胆甾-5-烯-3β,7α-二醇 ­ ­ 46 18 羟脯氨 83.55 0.02 63 42 胆甾醇硬脂酸酯 ­ ­ 167 19 天冬氨酸 79.74 0.02 31 43 磷脂酰胆碱 13.54 0.13 1901 20 脯氨酸 77.57 0.01 412 44 神经鞘磷脂 0.27 0.33 1274 21 谷氨酸 60.78 0.02 114 45 溶血磷脂酰胆碱 ­ ­ 844 22 十四烷酸 21.18 0.07 163 46 磷脂酰乙醇胺 ­ ­ 967 23 十六烷酸 19.30 0.1 370 47 次黄嘌呤 52.29 0.04 53 24 十八烷酸 17.83 0.14 355 2.2　海马“壮阳、益精”功效潜在靶点筛选 2 通过检索Gene card数据库，获得海马中47种主要成分对应5764个相关靶点，分别与1000个ED对应靶标和145个AS对应靶点取交集，得到海马-ED潜在靶点（Haima-ED）590个、海马-AS潜在靶点（Haima-AS）54个。见 图1 图1 。 注： A：海马“壮阳”功效靶基因590个；B：海马“益精”功效靶基因54个；C：海马“壮阳、益精”功效靶基因交互情况 2.3　海马“壮阳、益精”功效靶点PPI 2 分别将筛选到的海马“壮阳、益精”功效靶蛋白上传至String平台进行网络互作分析。PPI结果表明，海马“壮阳”功效PPI网络节点576个，平均度值为40.2，11567条边，中心介数0.454， P < 1.0E-16；以度值高于平均值、介数低于平均值为标准，筛选得到核心靶标218个。海马“益精”功效PPI网络节点54个，平均度值为3.7，100条边，中心介数0.56， P < 1.0E-16；以度值高于平均值、介数低于平均值为标准，筛选得到核心靶标19个。见 图2 图2 。 2.4　海马“壮阳、益精”功效核心靶标GO富集分析结果 2 海马“壮阳”功效核心药效靶点，共富集59个生物过程（BP），涉及52个细胞组分和48个分子功能（MF），见 图3 图3 ；海马“益精”功效核心药效靶点，共富集12个生物过程，涉及7种细胞组分和4种分子功能， 见 图4 图4 。 2.5　海马“壮阳、益精”功效核心靶标KEGG信号通路富集分析结果 2 应用DAVID 6.8生物信息在线分析平台，分别对海马的218个“壮阳”功效核心靶点和54个“益精”功效核心靶点进行KEGG通路富集分析。 根据 P < 0.01和FDR < 0.01对88条海马“壮阳”功效通路和6条海马“益精”功效的主要通路进行富集筛选，结果表明：（1）海马“壮阳”功效核心通路39条，对应四类主要功效成分，共有核心靶点基因133个，包括氨基酸类成分对应靶标123个，脂肪酸类成分对应靶标81个，甾体类成分对应靶标74个，磷脂等成分对应靶标95个。其中，排名前5的信号通路对应的核心靶点最多，分别为癌症发生信号通路（pathways in cancer）、磷脂酰肌醇3激酶信号通路（PI3K-AKT）、神经内分泌及神经信号传递（Neuroactive ligand-receptor interaction）、细胞因子相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）和Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）。（2）海马“益精”功效核心通路2条，对应四类主要功效成分，共有核心靶点基因7个，包括氨基酸类成分对应靶标7个，脂肪酸类成分对应靶标3个，甾体类成分对应靶标6个，磷脂等成分对应靶标2个。其中，涉及的核心通路分别为青春晚期糖尿病（Maturity onset diabetes of the young）和2型糖尿病（Type II diabetes mellitus）。见 图5 图5 。 2.6　海马“壮阳”“益精”功效的主要成分及参与的核心通路 2 共有35种主要化学成分协同发挥了“壮阳”功效的药理作用，主要成分包括14种氨基酸、10种脂肪酸、7种甾体和4种磷脂。其中,有12种核心功效成分参与10个以上靶基因的调节，分别为丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、精氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、胆固醇、磷脂酰胆碱、神经鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。共有22种主要化学成分协同发挥了“益精”功效的药理作用，主要成分包括9种氨基酸、5种脂肪酸、4种甾体和4种磷脂，分别为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳二烯酸、十四烷酸、胆固醇、胆甾-4-烯-3-酮、3β-羟基-胆甾-5烯-7-酮、胆甾-5-烯-3β、7α-二醇、磷脂酰胆碱、神经鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。 3 讨论 1 海马在我国及东南亚各国药用历史悠久，其“补肾壮阳”的功效广泛被认可，历版《中华人民共和国药典》均收载了海马“温肾壮阳”的功能主治 [ 15 15 - 16 16 15-16 ] 。本研究对《中华人民共和国药典》2020版所收录的5种海马的47种共有主要化学成分纳入研究，主要有氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等4大类成分，其中氨基酸类成分数量及含量占比最高，网络药理学研究结果表明氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等4类成分均为海马“壮阳、益精”功效的物质基础。 研究表明，在治疗勃起功能障碍方面，海马粉末可显著提高大鼠的性交能力和性功能，海马壮阳胶囊也可以增强大鼠的交配能力 [ 17 17 - 18 18 17-18 ] 。在治疗弱精方面，海马乙酸乙酯提取物具有减轻良性前列腺增生症状并逆转弱精症 [ 19 19 ] 。从文献查阅中可知，在海马壮阳、益精药理作用上，主要的有效部分是海马粉末和粗提物。本研究通过网络药理学分析发现，根据成分含量、口服生物利用度、类药性及参与调节相关基因的数目等指标综合筛选出的21种氨基酸类化合物、14 种脂肪酸类化合物、7种甾体类化合物和5种磷脂类化合物具有壮阳、益精的作用，这为海马壮阳、益精药理作用提供了有效的物质基础。 氨基酸在机体的含氮代谢、蛋白质合成和更新中占重要地位，并参与激素、酶、维生素和其他生物活性物质的合成。氨基酸的不足不仅导致精子生成障碍，而且严重影响精子的抗原活性。游离氨基酸参与活动精子的细胞代谢，是能量补充源，可以促进其活性，降低毒素的有害作用；必需氨基酸是合成核酸的重要原材料，补充必需氨基酸将改善机体合成核酸的能力，从而促进生精能力 [ 20 20 ] 。其中，酪氨酸参与调节激素水平和细胞代谢过程；精氨酸最显著的特点是产生 NO以维持机体氮平衡，与动物的繁殖性能有关；天冬氨酸盐是机体氮的来源之一；赖氨酸可调节NO的合成；甘氨酸作为核酸的组成成分之一，与精子的质量和数量有关 [ 21 21 ] 。据报道，口服补充L-精氨酸可显著增加大鼠阴茎组织NO水平和NOS活性 [ 22 22 ] 。彭建平等人通过给大鼠口服高剂量L-瓜氨酸8周，显著增强了大鼠阴茎的勃起功能 [ 23 23 ] 。研究表明，严重ED患者血清 L-精氨酸水平明显低于轻度ED患者 [ 24 24 ] ；体外L-精氨酸孵育可改善老龄大鼠海绵体对乙酰胆碱刺激的舒张反应 [ 25 25 ] ；口服L-精氨酸可改善男性不育患者的精子质量和勃起功能 [ 20 20 ] 。此外，氨基酸复配维生素能够提高精子质量 [ 26 26 - 28 28 26-28 ] 。本世纪初，我国研制出了主要由精氨酸氨和硫酸锌组成的复方氨基酸，临床试验结果显示其对AS有一定的疗效 [ 29 29 ] ，进一步证实了氨基酸类成分的“壮阳、益精”功效。除氨基酸类成分外，脂肪酸、甾体及磷脂等成分在治疗ED和AS方面也发挥了重要的作用。磷脂是动物和人体细胞膜的重要组成部分，具有强精益肾，提高机体免疫功能，保肝补血等作用，还与机体的生殖生理和激素的代谢密切相关 [ 30 30 ] 。脂肪酸和胆固醇是各种生物膜的重要组成部分，它们的缺失会致使精子受损 [ 31 31 ] ，其中，二十二碳六烯酸是前列腺及精子的主要物质基础 [ 32 32 ] 。日本学者曾报道海马乙醇提取物能使雄鼠前列腺、精囊、提肛肌的重量明显增加，具有雄激素样作用 [ 32 32 ] ，证实了脂肪酸、甾体、磷脂等成分改善ED和AS的药理作用。 综上，本研究对海马“壮阳、益精”的功效物质基础、潜在靶点和分子机制进行了初步解析，并为海马的现代药理的进一步研究指明了方向。 参考文献 赵晓喆 . 基于代谢组学技术研究不同海马商品药材化学成分差异性 [D]. 太原 ： 山西大学 ， 2018 . 基于代谢组学技术研究不同海马商品药材化学成分差异性 余 晟 , 吕圭源 , 陈素红 . 海马性味归经的相关药理研究 [J]. 安徽医药 , 2009 , 13 ( 5 ): 469 - 471 . 海马性味归经的相关药理研究 陈 梦 , 陈建真 , 葛宇清 , 等 . 海马化学成分及药理活性研究进展 [J]. 中草药 , 2017 , 48 ( 19 )： 4089 - 4099 . 海马化学成分及药理活性研究进展 魏祥东 , 陈东红 , 叶长明 . 海马的人工养殖现状及前景 [J]. 中山大学学报论丛 , 2002 , 22 ( 3 ): 236 - 239 . 海马的人工养殖现状及前景 许东晖 , 冯 星 , 梅雪婷 , 等 . 海马胶囊的补肾壮阳药理作用 [J]. 中药材 , 2000 , 23 ( 2 ): 98 - 99 . 海马胶囊的补肾壮阳药理作用 赖庆来 , 梁爱武 , 何妙仪 , 等 . 化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎的药理学机制探讨和网络药理学研究 [J]. 天然产物研究与开发 , 2020 , 32 ( 6 ): 909 - 919 . 化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎的药理学机制探讨和网络药理学研究 宋建波 , 廖 晖 , 李元平 . 基于网络药理学探讨黄芪治疗糖尿病肾病作用机制 [J]. 中草药 , 2020 , 51 ( 11 ): 2988 - 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