基于转录组学探讨益肾降浊汤对环孢素A肾毒性的作用及机制^※

基于转录组学探讨益肾降浊汤对环孢素A肾毒性的作用及机制 ※ 1 2 first-author 3 1 1 1 corresp 阮诗玮，男，主任医师，博士研究生导师，教授。研究方向：中西医结合肾脏病研究。E-mail：1476068677@qq.com 阮诗玮，男，主任医师，博士研究生导师，教授。研究方向：中西医结合肾脏病研究。E-mail：1476068677@qq.com 1476068677@qq.com 福建中医药大学附属人民医院肾病科（福建 福州 350000） 福建中医药大学附属人民医院肾病科（福建 福州 350000） 福建中医药大学附属第二人民医院肾病科（福建 福州 350000） 福建中医药大学附属第二人民医院肾病科（福建 福州 350000） 福建医科大学附属协和医院神经内科（福建 福州 350000） 福建医科大学附属协和医院神经内科（福建 福州 350000） 金冠羽 目的 2 基于转录组学探讨益肾降浊汤（YSJZT）治疗环孢素A（cyclosporine A，CsA）诱导人近端肾小管上皮细胞（Human kidney-2，HK-2）损伤的作用机制。 方法 2 采用CCK-8法检测HK-2细胞活力。HK-2细胞分为正常对照组（NC组）、模型组（C组）和治疗组（T组）。C组加入含CsA 16.8 μmol/L的培养基干预24 h后换常规培养基继续培养24 h；T组加入含YSJZT 0.5 mg/mL的培养基干预48 h，造模同C组。干预完成后提取各组细胞总RNA，进行转录组测序检测差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）。对交集的DEG进行GO功能显著性富集和KEGG通路显著性富集分析。 结果 2 益肾降浊汤可回调环孢素A诱导的HK-2细胞活性下降；C组与NC组比较得到显著DEG 1410个；T组与C组比较得到显著DEG 127个；交集得到的66个DEG通过GO功能富集，主要集中在分子功能部分的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定、雌激素酮磺基转移酶活性，生物学过程部分的雌激素代谢过程、表皮生长因子受体信号通路；KEGG通路富集主要在Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路、甾类激素生物合成通路、ErbB信号通路；主要涉及集落刺激因子2（Csf 2）、磺基转移酶1E家族成员1（Sult1E1）、上皮调节蛋白（EREG）等基因。 结论 2 益肾降浊汤通过多靶点恢复环孢素A诱导HK-2细胞损伤的细胞活力，其中调控Csf 2、Sult1E1、EREG多个靶基因及其相关信号通路，可能是其减轻CsA肾毒性的作用机制。 益肾降浊汤 环孢素A 人近端肾小管上皮细胞 转录组学 环孢素 A（cyclosporine A，CsA）目前广泛用于治疗实体器官移植及自身免疫性疾病，显著延长了移植器官的存活时间和患者的生命，但CsA的急慢性肾毒性制约其临床应用 [ 1 1 ] 。急性肾毒性与CsA损伤血管内皮细胞，导致肾血管收缩，肾脏血流灌注不足，肾小球滤过率下降有关；慢性肾毒性与CsA上调转化生长因子-β(TGF-β)，引起肾小管上皮细胞转分化、肾间质纤维化有关 [ 2 2 ] 。目前尚无肯定的可应用于临床的减轻CsA肾毒性的药物 [ 3 3 ] 。 中医认为，环孢素A肾损伤系药毒伤肾，导致脾肾亏虚为本，湿浊血瘀为标 [ 1 1 , 4 4 ] 。益肾降浊汤系福建省名中医阮诗玮教授治疗慢性肾功能衰竭的经验方，临床已使用30余年，疗效良好。益肾降浊汤“益肾健脾、降浊化瘀”之功效契合环孢素A肾损伤的病机，故课题检测益肾降浊汤对环孢素A诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响。鉴于中药复方成分复杂以及作用的多靶点，机制研究采用转录组测序(transcriptome sequencing，RNA-seq)技术分析益肾降浊汤治疗CsA诱导HK-2细胞损伤的差异表达基因，探讨益肾降浊汤减轻CsA肾毒性的可能靶点。 1 实验材料 1 1.1　实验细胞 2 HK-2细胞株（购自中国科学院细胞库）。 1.2　益肾降浊汤 2 益肾降浊汤由太子参15 g、生黄芪30 g、生白术15 g、茯苓15 g、槲寄生15 g、怀牛膝15 g、桑椹15 g、丹参30 g、当归10 g、大黄9 g、六月雪15 g、车前子15 g、陈皮10 g组成，所有中药饮片购自福建中医药大学附属人民医院中药房。浓煎为1.0 g/mL。YSJZT用0.22 μm无菌滤器过滤,分装放置-80 ℃冰箱保存备用。 1.3　主要试剂及仪器 2 环孢素软胶囊(新山地明，批准文号J20140116，诺华制药)。Cell Count Kit-8 （CCK-8）试剂（Cat:M4839-500Tests，Abmole BioScience）。胎牛血清（gibco 10099-141C）；DME/F12 Medium（hyclone SH30023.01B）；青霉素-链霉素（双抗）（100X）（hyclone SV30010）；TRYPSIN 0.25%（1X）Solution（hyclone SH30042.01）；TRIzol(上海生工B511311)。荧光相差倒置显微镜（NIKON ® ECLIPSE Ts2R-FL）；二氧化碳培养箱(SANYO MCO-15AC)。 2 实验方法 1 2.1　细胞培养 2 HK-2细胞株在DME/F12培养基（含10%胎牛血清及1%双抗）中培养，于37 ℃、5% CO 2 培养箱中培养。 2.2　益肾降浊汤对HK-2细胞活力的影响 2 取对数生长期的HK-2细胞，按5×10 3 个细胞/孔接种于 96 孔板中（100 μl/孔），每组5个复孔，放入培养箱内培养24 h后更换培养液。给予各浓度益肾降浊汤的培养液（0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL），同时设置正常对照和空白对照组（仅有培养基无细胞），置于培养箱内孵育48 h。各组干预完成后，每孔分别加入10 μlCCK-8试剂，孵育2 h后酶标仪检测450 nm处光密度值（OD值）。根据所测OD值计算细胞活力（%）=（YSJZT组-空白对照组）/（正常对照组-空白对照组）×100%。 2.3　CsA对HK-2细胞活力的影响 2 取对数生长期的HK-2细胞，按5×10 3 个细胞/孔接种于 96 孔板中（100 μl/孔），每组5个复孔，放入培养箱内培养24 h后更换培养液。用环孢素A软胶囊CsA原液直接稀释在培养基，给予各浓度的CsA培养液（4.2 μmol/L、8.4 μmol/L、12.6 μmol/L、16.8 μmol/L、21 μmol/L、42 μmol/L），同时设置正常对照和空白对照组（仅有培养基无细胞），置于培养箱内孵育24 h后更换为正常培养液继续孵育24 h。各组干预完成后，每孔分别加入10 μlCCK-8试剂，孵育2 h后酶标仪检测450 nm处OD值。根据所测OD值计算细胞活力（%）= （CsA组-空白对照组）/（正常对照组-空白对照组）×100%。 2.4　益肾降浊汤对环孢素A诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响 2 取对数生长期的HK-2细胞，按5×10 3 个细胞/孔接种于96孔板中（100 μl/孔），每组5个复孔，放入培养箱内培养24 h后更换培养液。根据CCK-8检测各浓度YSJZT和CsA影响HK-2细胞活力的结果,选择合理的CsA浓度诱导HK-2细胞损伤模型，孵育24 h后更换为正常培养液继续孵育24 h。并选择合理的YSJZT浓度干预CsA诱导HK-2细胞损伤模型48 h。同时设置正常对照和空白对照组（仅有培养基无细胞）。各组干预完成后，每孔分别加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后酶标仪检测450 nm处OD值。根据所测OD值计算细胞活力（%）=（CsA组或者YSJZT组-空白对照组）/（正常对照组-空白对照组）×100%。 2.5　细胞形态学改变 2 选择对数生长期的HK-2细胞按10 5 个/孔种入6孔板（2 mL/孔）。分3组：正常对照组（NC组）、模型组（C组，CsA 16.8 μmol/L）和治疗组（T组，YSJZT 0.5 mg/mL+CsA 16.8 μmol/L），药物浓度根据“2.3”和“2.4” CCK8检测结果选择，干预措施同“2.4”。各组干预完成后，相差显微镜下（200×）观察各组细胞形态改变。 2.6　转录组测序 2 选择对数生长期的HK-2细胞按10 5 个/孔种入6孔板（2 mL/孔）。分为NC组、C组（CsA 16.8 μmol/L）和T组（YSJZT 0.5 mg/mL+CsA 16.8 μmol/L），YSJZT对CsA诱导HK-2细胞损伤模型干预措施同“2.4”。各组干预完成后，采用Trizol法提取HK-2细胞总RNA，Agilent 2100进行RNA定量及质检。构建单链环状DNA文库，文库质检合格后通过DNBSEQ测序平台进行测序。由深圳华大基因股份有限公司完成。 2.7　差异表达基因筛选及交集DEG功能富集分析 2 采用DESeq进行比对组间显著差异基因分析，筛选比对组间差异表达基因，显著差异表达基因筛选条件为：|log2（fold change）|≥1；且Qvalue < 0.05。利用基因本体（Gene Ontology，GO）数 据 库 和 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，对交集的DEG进行GO功能与信号通路富集分析，以校正 P < 0.05为显著性阈值。 2.8　统计学方法 2 采用Graphpad prism 8.0软件进行分析，实验数据中的计量资料以均数±标准差( <math id="M1"><mover><mrow><mi>x</mi></mrow><mo>¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></math> http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=17386312&type= http://html.publish.founderss.cn/rc-pub/api/common/picture?pictureId=17386307&type= 7.28133297 3.21733332 )表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析， P < 0.05表示差异有统计学意义。 3 结果 1 3.1　益肾降浊汤对HK-2细胞活力的影响 2 各浓度YSJZT 处理48 h后，0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL对HK-2细胞活力无明显抑制，各组细胞活力分别为（103.20±1.98）%、（99.15±2.19）%、（97.42±3.58）%；1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL对HK-2细胞活力有统计学意义的抑制作用，各组细胞活力分别为（91.07±4.59）%、（89.45±1.70）%、（92.49±1.99）%。结果见 图1 图1 a。所以后续实验选择YSJZT 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL 三个浓度。 注： a.不同浓度益肾降浊汤对HK-2细胞活力的影响（n=5）；b.不同浓度CsA对HK-2细胞活力的影响（n=5）；c.不同浓度益肾降浊汤对CsA诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响（n=5）。独立实验重复3次。各组与NC组比较， * P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001；YSJZT组与CsA组比较， # P < 0.05， ## P < 0.01。NC：正常对照组；YSJZT：益肾降浊汤组；CsA：环孢素A组 3.2　CsA对HK-2细胞活力的影响 2 经过各浓度CsA处理24 h后，撤掉CsA继续培养24 h，4.2 μmol/L、8.4 μmol/L对HK-2细胞活力无抑制，各组细胞活力分别为（96.96±4.52）%、（88.36±6.24）%；12.6 μmol/L、16.8 μmol/L、21 μmol/L、42 μmol/L对HK-2细胞活力均有统计学意义的抑制，各组细胞活力分别为（84.18±7.36）%、（81.34±9.47）%、（28.68±13.97）%、（0.33±0.21）%。结果见 图1 图1 b。所以后续实验选择CsA 16.8 μmol/L诱导HK-2细胞损伤模型。 3.3　益肾降浊汤对CsA诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响 2 与NC组比较，CsA 16.8 μmol/L模型组HK-2细胞活力显著降低，其细胞活力为（76.48±3.16）%；与模型组比较，YSJZT 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL治疗后HK-2细胞活力明显提升，各组的细胞活力分别为（86.59±10.10）%、（87.64±5.91）%、（89.70±5.15）%。结果见 图1 图1 c。根据不同浓度YSJZT对CsA诱导HK-2损伤细胞活力的恢复情况，故课题后续实验选择YSJZT 0.5 mg/mL对模型进行干预。 3.4　益肾降浊汤对CsA诱导HK-2细胞损伤形态的影响 2 NC组细胞形态正常；C组为CsA诱导HK-2细胞损伤模型组，相差显微镜下HK-2细胞内发现大量大小不等的空泡及部分钙化点；T组为益肾降浊汤治疗组，HK-2细胞内空泡及钙化改善不明显。见 图2 图2 。 3.5　各比对组间差异表达基因情况 2 RNA-seq测序结果发现，C组与NC组比对得到显著差异表达基因1410个（其中上调基因812个、下调基因598个），见 图3 图3 a和 图3 图3 b。T组与C组比对得到显著差异表达基因127个（其中上调基因71个、下调基因56个），见 图4 图4 a和 图4 图4 b。为明确YSJZT减轻CsA肾毒性的主要靶基因，将T组比对C组上调DEG交集C组比对NC组下调DEG，得到36个DEG；将T组比对C组下调DEG交集C组比对NC组上调DEG，得到30个DEG，见 图5 图5 a和 图5 图5 b。 注： a.模型组比对正常对照组差异表达基因柱状图（X轴系C组比对NC组，Y轴系相应DEG数）；b.模型组比对正常对照组差异表达基因火山图（X轴系log2转换每组比对差异倍数值，Y轴系-log10转换筛选显著性值） 注： a.治疗组比对模型组差异表达基因柱状图；b.治疗组比对模型组差异表达基因火山图 注： a.治疗组比对模型组上调DEG交集模型组比对正常对照组下调DEG；b.治疗组比对模型组下调DEG交集模型组比对正常对照组上调DEG 3.6　差异表达基因GO功能富集分析 2 交集得到的66个DEG进行GO功能富集分析,从细胞组分( cellular component)、生物过程( biological process)和分子功能( Molecular Function)三大功能类别中各选取富集最显著的10个GO term绘制柱状图。通过GO功能富集分析可看出益肾降浊汤治疗后显著回调的差异基因功能主要集中在生物学过程中的雌激素代谢过程( estrogen metabolic process)、表皮生长因子受体信号通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway,EGFR）、视黄醇代谢过程（retinol metabolic process）；分子功能中的雌激素酮磺基转移酶活性（estrone sulfotransferase activity）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定( granulocyte macrophage colony-stimulating factor receptor binding)；细胞组分中的主要变化在细胞外间隙( extracellular space)、质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）。见图6。 结果发现，集落刺激因子2（Colony-Stimulating Factor 2,Csf 2）注释到分子功能的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定中；磺基转移酶1E家族成员1（sulfotransferase family 1E member 1，Sult1E1）注释到分子功能的雌激素酮磺基转移酶活性及生物学过程的雌激素代谢过程中；上皮调节蛋白（epiregulin，EREG）注释到生物学过程的EGFR信号通路中。 3.7　差异表达基因KEGG通路富集分析 2 差异表达基因KEGG通路富集分析以 P < 0.05为显著性阈值，对交集基因进行KEGG富集分析，以最显著变化的11个通路绘制气泡图，其中涉及的信号通路包括：甾类激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）、细胞色素P450代谢的生物异源物质（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、药物代谢-细胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450）、视黄醇的代谢（Retinol metabolism）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、FcεRI 信号通路（Fc epsilon RI signaling pathway）T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）等。见 图7 图7 。 图6 交集差异表达基因的GO富集分析三大功能类别柱状图 结果发现，Csf 2注释到Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路；Sult1E1注释到甾类激素生物合成通路；EREG注释到ErbB信号通路。 4 讨论 1 环孢素A肾损伤属于中医学“关格”“腰痛”等范畴 [ 1 1 ] 。环孢素A肾损伤系药毒伤肾，导致“脾肾亏虚”尤其是“肾精亏虚”；脾肾失运，导致湿浊内停；毒损肾络，瘀血内阻。脾肾亏虚、湿浊血瘀是CsA肾损伤的根本病机 [ 1 1 , 4 4 ] 。益肾降浊汤主要用于慢性肾功能衰竭“脾肾气虚，湿浊血瘀”证。方中太子参、生黄芪、生白术、茯苓健脾益气、利水渗湿；槲寄生、怀牛膝、桑椹益肾；丹参、当归、怀牛膝活血化瘀；大黄、六月雪、车前子通腑降浊解毒；陈皮健脾理气、助运降逆。诸药共奏益肾健脾，降浊化瘀之功效。在前期的基础研究中，益肾降浊汤 [ 5 5 ] 及其院内制剂益肾降浊冲剂治疗5/6肾切除慢性肾功能衰竭大鼠，均能改善大鼠肾功能和抑制肾小管间质纤维化 [ 6 6 , 7 7 ] 。益肾降浊汤之功效契合CsA肾损伤的病机。 故课题检测益肾降浊汤对环孢素A诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响。如 图1 图1 c所示，发现益肾降浊汤可回调环孢素A引起的HK-2细胞活性下降，因此益肾降浊汤是减轻环孢素肾毒性的有效药物。但YSJZT对环孢素A诱导HK-2细胞损伤细胞内空泡改善不明显，可能与环孢素A撤药后YSJZT继续干预时间仍偏短有关。 RNA-seq测序结果发现模型组与NC组比对得到显著差异表达基因1410个（其中上调基因812个、下调基因598个）；YSJZT治疗组与模型组比对得到显著差异表达基因127个（其中上调基因71个、下调基因56个）。为明确YSJZT减轻CsA肾毒性的主要靶基因，将T组比对C组上调DEG交集C组比对NC组下调DEG，得到36个DEG；将T组比对C组下调DEG交集C组比对NC组上调DEG，得到30个DEG。对交集的66个基因进行GO 富集分析,可看出YSJZT治疗后显著回调的差异基因功能主要集中在生物学过程中的雌激素代谢过程、表皮生长因子受体信号通路、视黄醇代谢过程，分子功能中的雌激素酮磺基转移酶活性、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定。KEGG通路富集分析发现，涉及信号通路有甾类激素生物合成、ErbB信号通路、FcεRIFc 信号通路、T细胞受体信号通路等。提示益肾降浊汤减轻环孢素A肾小管细胞毒性的作用机制比较广泛。 Csf 2在GO功能分类分子功能中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定和KEGG pathway富集的Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路中发挥作用。肾损伤后巨噬细胞在肾内积聚，并经历由促炎(M1)表型向正常修复所需的选择性激活(M2)表型的转变。在人M1巨噬细胞与HK-2细胞共培养的培养基中Csf 2增加最多，Csf 2只由HK-2细胞分泌。重组人Csf 2蛋白促进巨噬细胞由M1向M2表型转化。暴露于外源性Csf 2后，M1巨噬细胞诱导的HK-2细胞凋亡和活性氧释放减弱。在盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠腹腔注射Csf 2中和抗体会加重肾损伤，抑制肾小管增殖，进而降低存活率。而重组小鼠Csf 2蛋白可以挽救脓毒症小鼠 [ 8 8 ] 。慢性环孢素A肾毒性患儿肾活检组织病理发现间质巨噬细胞浸润 [ 8 8 ] ，同时在慢性CsA肾毒性大鼠也发现肾间质巨噬细胞浸润，与肾间质纤维化密切相关 [ 10 10 ] 。本研究结果发现，环孢素A干预HK-2细胞后Csf 2显著下调[log2(C/NC)=-2.043]，益肾降浊汤治疗后显著回调[log2(T/C)=1.255] ，提示益肾降浊汤上调Csf 2是其减轻环孢素A肾毒性的可能靶点之一。 Sult1E1在GO分类分子功能中的雌激素酮磺基转移酶活性、生物学过程中的雌激素代谢过程和KEGG pathway富集的甾类激素生物合成通路中发挥作用。研究表明雌激素可以减轻小鼠急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI),雌激素Sult1E1通过磺化和失活雌激素在雌激素稳态中发挥重要作用，在小鼠急性肾缺血再灌注损伤模型，Sult1E1基因敲除或对其药理抑制减轻了雌雄小鼠AKI，与性激素的存在无关。Sult1E1在AKI的发病机制中具有新的功能 [ 11 11 ] 。本研究结果发现，环孢素A干预HK-2细胞后Sult1E1显著上调[log2(C/NC)=3.153]，益肾降浊汤治疗后显著回调[log2(T/C)=-1.177] ，提示益肾降浊汤抑制Sult1E1可能是其减轻环孢素A肾毒性的作用机制之一。 EREG在GO分类生物学过程中的EGFR信号通路和KEGG pathway富集的ErbB信号通路中发挥作用。Epiregulin与表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）在促进肾近端小管上皮细胞（renal proximal tubular cells，RPTC）增殖和迁移方面具有相当的作用。表皮调节蛋白是RPTC的一种有效的有丝分裂原，可能通过激活EGFR和PI3K/Akt通路促进肾脏再生 [ 12 12 ] 。本研究结果发现，环孢素A干预HK-2细胞后EREG显著下调[log2(C/NC)=-3.689]，益肾降浊汤治疗后显著回调[log2(T/C)=1.653] ，提示益肾降浊汤上调EREG可能是其减轻环孢素A肾毒性的作用机制之一。但在体内过量的EGFR和ErbB信号激活是有害的 [ 13 13 ] ，故益肾降浊汤在体内对EREG的调控需要进一步研究，以全面了解YSJZT对EREG的调控。 综上，益肾降浊汤通过多靶点恢复环孢素A诱导HK-2细胞损伤的细胞活力，其中调控Csf 2、Sult1E1、EREG多个靶基因及其相关信号通路，可能是益肾降浊汤减轻环孢素A肾毒性的作用机制。以上分析的可能靶基因仍需要体内外实验进一步验证。 参考文献 韩 聪 , 胡洪贞 , 周 乐 , 等 . 基于“肠-肾轴”理论探讨芪黄四物汤对环孢素A慢性肾毒性的保护机制 [J]. 中华中医药杂志 , 2020 , 35 ( 5 ): 2623 - 2627 . 基于“肠-肾轴”理论探讨芪黄四物汤对环孢素A慢性肾毒性的保护机制 王晓磊 , 文 彬 , 邹 川 , 等 . 黄春林教授运用中医药防治环孢素A肾毒性的策略 [J]. 世界科学技术-中医药现代化 , 2020 , 22 ( 4 ): 1142 - 1147 . 黄春林教授运用中医药防治环孢素A肾毒性的策略 田普训 , 敖建华 , 李 宁 , 等 . 器官移植免疫抑制剂临床应用技术规范(2019版) [J]. 器官移植 , 2019 , 10 ( 3 ): 213 - 226 . 器官移植免疫抑制剂临床应用技术规范(2019版) 钟燚梦 , 余 亨 , 鲁科达 . 中医药防治环孢素肾毒性研究进展 [J]. 浙江中西医结合杂志 , 2021 , 31 ( 1 ): 89 - 92 . 中医药防治环孢素肾毒性研究进展 张喜奎 , 吴起浩 . 益肾降浊汤对慢性肾功能衰竭大鼠肾间质纤维化的影响 [J]. 河南中医 , 2009 , 29 ( 5 ): 451 - 454 . 益肾降浊汤对慢性肾功能衰竭大鼠肾间质纤维化的影响 郑敏麟 , 骆丹岚 , 阮诗玮 . 益肾降浊冲剂对慢性肾功能衰竭肾脏的保护作用及其对肾脏自由基、肾小管Caspase-3和Caspase-9表达的影响 [J]. 中华中医药杂志 , 2019 , 34 ( 8 ): 3460 - 3464 . 益肾降浊冲剂对慢性肾功能衰竭肾脏的保护作用及其对肾脏自由基、肾小管Caspase-3和Caspase-9表达的影响 XU Y , RUAN S , LIN J , et al . 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